Как приручить эндосимбионтов. Выращивание клеток и тканей вместо трансплантации

Когда-нибудь я хотел бы рассказать на Хабре о величайшей «инсайдерской сделке ^[1]» в истории нашей планеты — как хлоропласты и митохондрии стали симбионтами эукариотов, а затем были ими порабощены, по-видимому, утратив большую часть генома и сначала потеряв способность жить вне клетки-хозяина, а затем и превратившись в известные нам органеллы. Но за исследованием этой темы мне попался сюжет, достойный отдельной публикации на Хабре, которую вы сейчас видите.

Одной из самых высокотехнологичных и жизненно необходимых операций в арсенале современной медицины является трансплантация органов и тканей. При этом такие операции до сих пор остаются крайне инвазивными и рискованными как из-за глубины хирургического вмешательства, так и из-за опасности иммунного отторжения трансплантата. Ещё в 2018 году уважаемый Максим Агаджанов @marks писал на Хабре об искусственной коже ^[2], изобретённой в Массачусетском технологическом институте для покрытия бионических протезов. Но меня заинтересовало, а существует ли хотя бы в статусе НИОКР технология, которая позволила бы отказаться от трансплантации органов и (хотя бы в молодом организме, пострадавшем из-за болезни или травмы, а не из-за одряхления) аккуратно восстанавливать органы и ткани? В наше время подобные наработки уже существуют, они связаны с использованием искусственных бактерий и биоплёнок в области точной медицины с применением генной инженерии.

Если какой-то из жизненно важных органов отказывает в результате травмы или критической недостаточности, то иногда нет другого выхода, кроме как заменить его донорским органом (но существуют и более экзотические технологии ^[3], о которых упоминает на Хабре уважаемая @Ekaterina_T, также обратите внимание ^[4] на комментарий уважаемого @Meklon к её статье). Тем не менее, донорских органов всегда не хватает, требования к их транспортировке ^[5] очень сложны, а риск иммунного отторжения ^[6] исключить невозможно. Срок ожидания донорского сердца или лёгкого в США составляет около 4 месяцев, срок ожидания донорской почки достигает 5 лет.

Поэтому остро требуется технология, которая позволяла бы восстанавливать или заменять нефункциональные органы прямо внутри тела, чтобы этот процесс напоминал не пересадку, а латание. Например, после пережитого инфаркта можно было бы заменить свежей мышечной тканью сам рубец, а при болезни Паркинсона выращивать новые нейроны ^[7] в темпе, умеренно превышающем темп отказа собственных нейронов пациента. Кроме того, этот метод был бы полезен и при старческих или хронических заболеваниях, когда некоторые ткани (например, хрящи или коллагеновые волокна) изнашиваются по чисто механическим причинам.

Опытным путём доказано, что взрослые соматические клетки можно превращать ^[8] в плюрипотентные стволовые клетки, перепрограммируя их на уровне генома. Эта технология освоена in vitro, но для её адаптации к in vivo требуется биохимический механизм, который не приводил бы к неконтролируемому делению стволовых клеток, образованию тератом ^[9] и раковых опухолей. Такое решение может иметь вид искусственных органелл (эндосимбионтов), которые внедряются в клетки поражённого/протезируемого органа (ткани) и действовать как переключатели, направляющие процесс восстановления ткани.   

Разработкой подобных органелл на основе прокариотических клеток (бактерий) занимается, в частности, группа под руководством Криса Контага в университете штата Мичиган (на базе Инженерного колледжа ^[10]). Давайте уточним как такой эндосимбиоз соотносится с обычным симбиозом, а также как бактерию превращают в генетический инструмент.  

Что такое эндосимбиоз

Симбиоз — это тесные взаимно благоприятные отношения особей неродственных видов. Симбиоз повышает шансы на выживание для всех участников этого союза. Все поклонники мультфильма «В поисках Немо» знают о симбиозе морских анемонов (актиний) и рыб-клоунов ^[11].

Симбиоз может быть не только полезной опцией, но и необходимым условием выживания. На макроуровне наиболее ярким примером такого рода являются лишайники, представляющие собой симбиоз грибов и водорослей ^[12]. В случае с лишайниками водоросли, пожалуй, Являются более важным участником такого союза, поскольку обеспечивают систему питанием (благодаря фотосинтезу), а грибы дают водорослям опору и защиту.

Аналогично, эндосимбионт — это небольшая (в нашем случае — генетически модифицированная) клетка бактериального происхождения, живущая внутри более крупных эукариотических клеток, из которых состоят органы и ткани животных и растений. Команда Криса Контага внедряет в безвредные бактерии гены эукариот, служащие для взаимодействия такого микроорганизма с клеткой-хозяином, а потом методом направленной эволюции сокращает геном эндосимбионта до такого необходимого минимума, который позволял бы ему выполнять свои функции, но при этом не приводил к конкуренции эндосимбионта с хозяином за питательные вещества и другие ресурсы. Таким образом, эндосимбионт не пытается навредить хозяину (не превращается в паразита). В геном таких искусственных бактерий внедряются гены, кодирующие светящиеся пигменты ^[13]. Благодаря этим пигментам, эндосимбионтов проще находить в организме хозяина, а также контролировать, активны ли генетически изменённые гены. Кроме того, характер свечения позволяет судить, правильно ли работает вся система.  

 Искусственные эндосимбионты ^[14] сделаны по образу и подобию митохондрий. Модифицированный бактериальный геном остаётся изолирован от клетки-хозяина, что принципиально отличает эндосимбионтов от генетических векторов, плазмид или внеклеточных препаратов. Поскольку у эндосимбионта есть своя оболочка, на ней можно разместить рецепторы ^[15], реагирующие как на биохимические изменения в самой клетке, так и на сигнальные препараты, вводимые в организм экспериментатором или врачом. Эндосимбионт реагирует на эти стимулы строго определёнными откликами на молекулярном уровне, которые выполняются подобно короткой программе или скрипту. Кроме того, набор генов эндосимбионта позволяет не только управлять им на уровне биохимии, но и задействовать пространственную транскриптомику ^[16], протеомику и делать внутриклеточные «снимки». Для этого создаются цепочки последовательно срабатывающих генов, и эти генетические контуры обладают заданными свойствами.  Такой пространственный подход к изучению биохимии позволяет отслеживать межклеточные взаимодействия как в здоровых, так и в поражённых тканях, картировать функции целого объёма ткани (в трёх измерениях), а не просто исследовать разрозненные клетки в культуре. Таким образом, отслеживается поведение ^[17] клеток в ткани как в экосистеме; следовательно, реконструируется структура и логика ^[18] поведения ^[19] ткани. Затем эта информация используется в качестве шаблона для диагностической и/или лечебной работы с участием эндосимбионтов. Именно при регенерации нейронов и синапсов такой пространственный подход принципиально важен.

Интеграция таких диагностических и восстановительных свойств эндосимбионтов открывает возможности для гораздо более продвинутой терапии, чем простое стимулирование работы ткани, где выраженность стимула ^[20] зависит от дозировки препарата, а работа отдельных клеток не контролируется. Перепрограммирование соматических клеток в стволовые при помощи эндосимбионтов поддаётся динамической количественной оценке, визуализации и итеративному улучшению. В таком контексте    генно-инженерный эндосимбиоз ^[21] превращается в программируемую процедуру с детализацией вплоть до отдельных клеток. Метод позволяет в режиме реального времени оценивать, как изменения распространяются по ткани и не допускать, чтобы они становились патологическими или злокачественными. Фактически, это постепенная перенастройка клеток и контролируемая (а не стохастическая) регенерация на клеточном уровне.

Генетически изменённые бактерии для перепрограммирования клеток

В настоящее время аналогичные задачи, связанные с перепрограммированием клеток, как правило, решаются при помощи вирусных векторов. Вирус, встраиваясь в клетку, привносит в неё и генетическую полезную нагрузку. Это грубая технология, с которой связаны серьёзные риски — например, мутации при генетических вставках и необратимые изменения клеток. В случае с эндосимбионтами разница очевидна — симбионт заносит в клетку-хозяина нужный генетический материал, не затрагивая при этом её геном, благодаря чему коррекция работы клетки протекает плавно и гораздо более безопасно.   

В середине 2010-х естественный потенциал для такого перепрограммирования эукариотических клеток был открыт у некоторых патогенов. Так, в 2015 году Хесс и Рамбуккана показали, что Mycobacterium leprae (возбудитель проказы) может in vivo изменять клетки Шванна, после чего они начинают напоминать стволовые, а также способствовать их пролиферации и миграции. Такие изменения также позволили выявить на мышиных моделях биохимические пути, перспективные с точки зрения ^[22] регенерации тканей. В случае с возбудителем проказы этот процесс приводит к распространению инфекции, но принципиально способствует регенерации ткани и позволяет обойтись без пересадки донорских стволовых клеток. Совершенствуя эти возможности in vivo, Хесс в 2022 году показал, как при помощи генетически изменённых бактерий частично перепрограммировать клетки печени ^[23], запустив регенерацию печёночной ткани без фиброза и без возникновения злокачественных опухолей.

Подобная стратегия оказалась ещё более действенной при лечении болезни Паркинсона, так как позволяет перепрограммировать астроциты ^[24] (подробно об этих клетках мозга ^[25] и об их функции я ранее писал на Хабре в статье «Звёзды у нас в голове») в дофаминергические нейроны ^[26]. Поскольку астроциты гораздо крупнее нейронов и обладают ветвистой структурой, по ним легко добраться глубоко в поражённые зоны мозга; сами эндосимбионты легко проникают в астроциты путём эндоцитоза и перепрограммируют глию ^[27] в нервную ткань. Для этого эндосимбионты прицельно доставляют в зону мёртвых и деградирующих нейронов нужные факторы транскрипции, замедляющие этот процесс — например, ASCL1, LMX1A и NURR1, способствующие регенерации дофаминергических нейронов.  Притом, что долгосрочные последствия такого вмешательства пока не изучены, к очевидным достоинствам данного метода можно отнести возможность обходиться без трансплантации и уменьшение иммунного ответа.

Генетически изменённые бактерии могут действовать не только в качестве эндосимбионтов (притом, что эта функция у них сохраняется), но и в качестве носителей, доставляющих белки во внеклеточный матрикс. Эти белки используются, например, как катализаторы дифференциации клеток. Бактерии-эндосимбионты могут в течение заданного времени (собственного жизненного цикла) пребывать в цитоплазме эукариотической клетки-хозяина, экспрессируя и выделяя белки, выполняющие сигнальные функции, регулирующие дозировку препаратов в клетках (например, препятствующие дальнейшему поступлению препарата после накопления нужной дозы), а также контролировать биохимические пути, используемые при перепрограммировании клеток. Такие технологии известны под общим названием «индуцированная регуляция работы генов».

Важнейшей составляющей описываемых технологий является тот инициирующий фактор, при воздействии которого эндосимбионты переходят к активным действиям, то есть, к усиленной экспрессии нужных генов. В качестве таких факторов первоначально использовались химические сигналы и повышение температуры, но такие факторы действуют только по нарастающей. После того, как нужный процесс или биохимический путь активирован, требуется время либо на понижение температуры тканей, либо на выведение препарата-триггера. Для устранения этих недостатков тестируются также эндосимбионты с вкраплениями магнитных частиц, на экспрессию генов в которых можно влиять простым включением магнитного поля или изменением полярности магнита. Такой метод, опять же, полезен при работе с нервной тканью, которая по природе своей приспособлена для передачи электромагнитных импульсов. Поскольку даже частично деградировавшая нейронная ткань представляет собой клеточную сеть, магнитный метод при работе с ней представляется наименее инвазивным, поддающимся тонкой регуляции, а также наиболее точным и безопасным.         

Примеры синтеза биоматериалов с использованием генетически модифицированных клеток

Описанные выше методы поспособствовали развитию целой прикладной области, которая называется «инженерия тканей». В качестве инструмента и носителя генов в ней могут использоваться не только прокариоты, но и эукариоты. Эта область смыкается с бионикой, так как ведущиеся в ней исследования призваны расширить генетический материал клеток в целевой ткани, чтобы они не только способствовали регенерации этой ткани, но и могли производить биополимеры с заданными или известными свойствами. Хотя такие технологии и не связаны с использованием стволовых клеток, их также можно отнести к перепрограммированию генома. В среднесрочной перспективе они могут значительно снизить потребность ^[28] в имплантации костной, хрящевой и даже мышечной ткани, поскольку позволят постепенно регенерировать эти ткани прямо на месте травмы из биоматериалов хозяина. Также такие технологии открывают путь к дешёвому синтезу важных и дорогостоящих биополимеров, в частности, шёлка и коллагена.  

Коллаген — это тягучий белок, способствующий поддержанию целостности и структуры тканей. Он применяется как в восстановительной медицине при заживлении ран, так и в косметических процедурах. В настоящее время в этих целях используется коллаген, взятый у млекопитающих, в частности, коров и свиней, и он не исключает таких опасных побочных эффектов, как заражение патогенами от животных или развитие аутоиммунных реакций ^[29]. Но таких недостатков лишён коллаген типа 0, образующийся в организме медуз; кроме того, он выигрывает у аналогов в биосовместимости с человеческими клетками и быстрее заживляет раны. Генная инженерия позволяет перепрограммировать бактерий на синтез такого коллагена.    

Наконец, остановлюсь ещё на одной схожей проблеме, потенциально решаемой путём перепрограммирования человеческих клеток. Это замена синтетических имплантатов, в том числе, настолько важных, как искусственные сердечные клапаны. Исследованиями в этой области занимается компания «Xeltis», которая базируется в Эйндховене и образовалась в 2006 году в результате слияния двух стартапов — голландского и швейцарского. Компания изготавливает биосовместимый полимер, вырабатываемый генетически изменёнными клетками и функционально аналогичный веществу, используемому при протезировании сердечных клапанов и участков кровеносных сосудов. Оказавшись в организме пациента, клетки с кровотоком достигают имплантата, обволакивают его и начинают постепенно заполнять поры, образующиеся при его износе. Процесс протекает плавно и с тем же успехом применим для восстановления аналогичных тканей у пациентов, которым вообще не делали имплантацию — например, при укреплении сердечных клапанов у детей с пороками сердца. На момент подготовки этой статьи метод проходит стадию клинических испытаний.

Заключение

Даже этот краткий экскурс в инженерию тканей и раннюю историю регенеративной медицины с использованием эндосимбионтов открывает фантастические перспективы, которые и побудили меня вам о нём рассказать. Потенциально такие разработки могут привести к отказу от механического протезирования, так как позволят выращивать мышцы и кости с заданными свойствами, в том числе, рассчитанные на низкую марсианскую гравитацию, а также восстанавливать ткани без пересадки. Эти наработки представляются наиболее действенным методом борьбы с нейродегенеративными заболеваниями, в том числе, с боковым амиотрофическим склерозом, и даже могут обогатить наш организм новыми (полу)синтетическими тканями, которые позволят человеческому организму извлекать энергию из различных участков электромагнитного спектра по принципу, напоминающему фотосинтез. Приглашаю вас поговорить об этом в комментариях.