Инструкция по секвенированию собственной ДНК в домашних условиях

Я уже пять раз секвенировал свой геном с помощью портативного секвенатора MinION, разработанного Oxford Nanopore Technologies ^[1]. Этот процесс включает взятие мазка, его подготовку, пропуск через секвенатор и последующий анализ. Для этой задачи хорошо подходит буккальный эпителий (клеточная ткань внутренней поверхности щёк) — он легко доступен и быстро восстанавливается. Однако эти ткани не подходят для диагностики рака, выявления воспалений или оценки экспрессии генов в других частях тела. Например, если у вас сыпь на груди и вы хотите узнать, какие гены экспрессируются в воспалённых клетках, вам нужно собирать именно эти проблемные клетки и сравнивать с их здоровыми образцами.

Для секвенирования клеток я купил специальный лабораторный материал и расходники. Мне пришлось около двух месяцев собирать всё необходимое, чтобы выполнить качественный процесс от и до. К тому же, стоит это всё очень дорого для рядового человека, хотя цены снижаются (причём экспоненциально!). Так что в будущем мы получим вполне доступную технологию — как это было с сотовыми телефонами или ИИ — которая позволит нам в реальном времени узнавать экспрессию генов ДНК и РНК ^[2].

А что мне даст знание своего генома?

Прежде чем тратить кучу денег и времени на секвенирование, нужно ответить на вопрос, а что вообще нам даст изучение своего генома?

Сам по себе геном — это не какая-то магия, а фундаментальный справочный слой для всего организма. Как только я получу файл VCF (формат вызова вариантов), то смогу прогнать его через различные инструменты вроде VEP ^[3], ClinVar ^[4], gnomAD ^[5], PharmGKB ^[6] (очень рекомендую), Gene Inspector ^[7] или Claude и начать задавать вопросы типа:

• Какие у меня есть генетические варианты?

• Какие гены и метаболические пути затронуты?

• Какие лекарства мой организм может усваивать нестандартно?

• На какие редкие варианты мне следует обратить внимание ^[8]?

• В каких областях модель ещё пока ничего не знает?

И последний пункт очень важен. Он говорит о том, что полученная информация пока не является медицинским диагнозом. И здесь явно нельзя действовать в духе «Пойду отредактирую себя с помощью CRISPR, потому что так посоветовал ИИ». Основная ценность заключается в том, чтобы превратить статичный геном в интерактивную базу данных, к которой можно делать запросы. Но позже наверняка появится и возможность редактирования через CRISPR. ДНК — это стабильная матрица, РНК — текущее состояние организма, и со временем мы объединим данные всех биосенсоров в единую «модель» своего тела.

Вот вам полезный список справочных ссылок и постов в Twitter*:

• Анализ генетических вариантов на основе фундаментальных законов природы: пост пользователя Adib @ ICML в X ^[9].

• Кратко: эти гены и их комбинации приводят к реальным физическим недугам. И в ближайшие десять лет мы наверняка уже составим полный каталог этих взаимосвязей.

• Передайте ваш геном и РНК на анализ любой из моделей с ресурса Biotender: https://www.biotender.online/bio-model-install-guide/ ^[10]

• Покажите свой геном Claude Code. Отпишите мне, если нужна помощь в настройке.

• Обязательно сообщайте докторам ^[11], если ваш организм как-то по-особенному усваивает те или иные препараты.

• Статья Патрика Коллисона ^[12] на тему использования агентов для интерпретации и анализа геномных данных.

Этапы протокола

Информации здесь очень много — можете изучить её сами или скормить ИИ. Не стесняйтесь просто скопировать ссылку на эту страницу и попросить ChatGPT разъяснить вам все шаги. Ещё лучше, если у вас есть AR-очки — тогда ИИ сможет буквально провести вас за руку через все этапы выполнения протокола.

Оборудование

• Oxford Nanopore Technologies MinION ^[13] ($7.5k).

• Ноутбук/рабочая станция для MinKNOW (сгодится любой ПК).

• 100+ ГБ пространства для хранения результатов.

• GPU для перевода сигналов в текст через Dorado.

• Vortex ^[14] ($50).

• Термоблок ^[15] ($250).

• Центрифуга ^[16] ($400 подержанная на eBay).

Расходные материалы

• Набор для лигирования и секвенирования ДНК (SQK-LSK114 Ligation Sequencing Kit V14 ^[17]).

• Набор для промывки проточных ячеек (EXP-WSH004 Flow Cell Wash Kit ^[18]).

• Контрольный материал (EXP-CTL001 Control material ^[19]).

• 1х фосфатно-солевой буфер (PBS 1x ^[20]).

• Буккальные зонды Isohelix Buccal swabs ^[21].

Реагенты

• Набор для извлечения ДНК:

  • Набор NEB Monarch HMW DNA Extraction Kit ^[22] для выделения высокомолекулярной ДНК из клеток и крови ($87 за 5 запусков):

    • буфер для подготовки ядер (Nuclei Prep Buffer),

    • буфер для лизиса ядер (Nuclei Lysis Buffer),

    • РНКаза А (RNase A),

    • протеиназа K (Proteinase K),

    • усилитель осаждения (Precipitation Enhancer),

    • бусины для захвата ДНК (DNA Capture Beads),

    • буфер для промывки гДНК (gDNA Wash Buffer),

    • буфер для элюции II (Elution Buffer II),

    • фиксаторы шариков и сборные пробирки.

• Реактивы для подготовки библиотек ДНК:

  • Cопутствующий модуль NEBNext Companion Module v2 ^[23] / реагенты для репарации и подготовки концов ДНК ($760 за 24 реакции ^[24]):

    • буфер для репарации FFPE ДНК (FFPE DNA Repair Buffer),

    • смесь для репарации FFPE ДНК (FFPE DNA Repair Mix),

    • Реакционный буфер для подготовки концов Ultra II (Ultra II End-prep Reaction Buffer),

    • Ферментная смесь для подготовки концов Ultra II (Ultra II End-prep Enzyme Mix),

    • Быстрая ДНК-лигаза Т4 NEBNext (NEBNext Quick T4 DNA Ligase).

  • Набор Oxford Nanopore SQK-LSK114 ^[25] ($720 за 6 реакций):

    • буфер для длинных фрагментов (LFB),

    • буфер для элюции (EB),

    • адаптер для лигирования (LA),

    • буфер для лигирования (LNB),

    • буфер для секвенирования (SB),

    • шарики для библиотеки (Library Beads, LIB),

  • Реактивы для прайминга проточной ячейки (Flow cell priming reagents):

    • раствор для промывки проточной ячейки (Flow Cell Flush, FCF),

    • фиксатор для проточной ячейки (Flow Cell Tether, FCT),

    • бычий сывороточный альбумин (BSA),

  • магнитные шарики AMPure XP (AMPure XP beads),

  • 80%-й этанол,

  • вода, свободная от нуклеаз ^[26] ($32 за 25 мл).

• Измерение количества ДНК:

  • флуориметр Qubit,

  • набор реактивов Qubit dsDNA BR/HS Assay Kit для анализа двухцепочечной ДНК (широкого диапазона [BR] или высокой чувствительности [HS]).

Лабораторное оборудование

• Микроцентрифуга,

• Вортекс,

• Тремостат / твердотельный термостат (Heat block),

• Магнитный штатив для пробирок 1,5 и 2 мл (Magnetic rack),

• Штативы для пробирок,

• Ведёрко для льда / охлаждающий блок,

• Морозильная камера с температурой -20°C,

• Холодильник с температурой 4°C,

• Дозаторы (Pipettes):

  • P1000 ^[27] (100—1000 мкл),

  • P200 ^[28] (0—200 мкл),

  • P20 ^[29] (2—20 мкл),

  • P10 ^[30] (1-10 мкл).

Пластик и профессиональные лабораторные материалы

• Cтерильные флокированные зонды для буккального мазка (flocked cheek swabs).

• Микроцентрифужные пробирки 1,5 мл.

• Микроцентрифужные пробирки 2,0 мл.

• Пробирки DNA LoBind на 1,5 мл (DNA LoBind 1.5 mL tubes).

• Пробирки RNA LoBind (RNA LoBind tubes).

• ПЦР-пробирки 0,2 мл.

• Пробирки для анализа на флуориметре Qubit (Qubit assay tubes).

• Стерильные наконечники с фильтром для дозаторов (Pipette sterile filtered tips):

  • P1000 ^[31] (100—1000 мкл).

  • P200 ^[32] (0—200 мкл).

  • P20 ^[33] (2—20 мкл).

  • P10 ^[34] (1-10 мкл).

• Наконечники с широким носиком P200 (Wide-bore P200 tips).

• Лабораторный маркер и этикетки для пробирок.

• Перчатки ^[35].

Программное обеспечение

• MinKNOW,

• Dorado,

• minimap2,

• samtools,

• mosdepth,

• NanoPlot or pycoQC,

• Clair3,

• DeepVariant, не обязательно,

• Ensembl VEP,

• ClinVar,

• gnomAD,

• PharmGKB,

• dbSNP, не обязательно,

• Python/R,

• SQLite/Postgres для последующих запросов.

Комплексный протокол секвенирования ДНК

Цель — пройти весь путь от двух мазков со щеки до их секвенирования на приборе MinION.

0. Подготовка

• Наденьте перчатки.

• Очистите рабочее место.

• Промаркируйте пробирки:

  • Cheek sample (проба со щеки),

  • Extracted DNA (извлечённая ДНК),

  • End-prep (подготовка концов ДНК),

  • Ligation (лигирование),

  • Final library (готовая библиотека),

  • Priming mix (смесь для прайминга),

  • Loading mix (смесь для загрузки).

• Нагрейте магнитные шарики AMPure XP до комнатной температуры.

• Держите ферментные смеси в холоде.

• Настройте термоблок на 56°C.

• Держите буфер для подготовки ядер (Nuclei Prep Buffer) в холоде.

• Убедитесь, что в буфер для промывки геномной ДНК (gDNA Wash Buffer) уже добавлен этанол.

• Проверьте наличие изопропанола, он понадобится для связывания ДНК.

• Убедитесь, что у вас есть свежеприготовленный 80% этанол для очистки ДНК на шариках AMPure.

• Убедитесь, что у вас подготовлены все необходимые реагенты от ONT:

• буфер для репарации (FFPE DNA Repair Buffer v2),

• смесь для репарации (FFPE DNA Repair Mix),

• ферментная смесь для подготовки концов (N-Prep Enzyme Mix),

• солевая лигаза T4 для сшивания (Salt-T4 DNA Ligase),

• буфер для лигирования (LNB),

• адаптер для лигирования (LA),

• буфер для длинных фрагментов (LFB),

• буфер для элюции (EB),

• буфер для секвенирования (SB),

• шарики для библиотеки (LIB),

• раствор для промывки проточной ячейки (FCF),

• фиксатор для проточной ячейки (FCT).

1. Взятие мазка со щеки

Цель: собрать как можно больше клеточного материала в раствор PBS:

• Прополощите рот водой.

• Подождите 10 минут.

• Не чистите зубы.

• Не используйте ополаскиватель для рта.

• С усилием потрите внутреннюю часть щеки зондом в течение 60 секунд.

• Влейте в пробирку «Cheek sample» 1 мл охлаждённого раствора PBS.

• Поместите кончик зонда в PBS.

• Вортексируйте в течение 10 секунд.

• Отожмите зонд об стенки пробирки.

• Извлеките и выбросите зонд.

Как выглядит успешный результат:

Допускается помутнение раствора PBS.

2. Осаждение клеток

Цель: сконцентрировать клетки на дне пробирки и удалить излишки PBS.

• Центрифугируйте образец с ускорением 2 000 × g в течение 30 секунд.

• На дне пробирки должен образоваться небольшой белый или сероватый осадок.

• Удалите основную часть раствора с помощью дозатора P1000.

• Аккуратно удалите оставшийся с помощью дозатора P200.

• Оставьте около 50-100 мкл над осадком.

• Слегка постучите пальцем по пробирке, чтобы ресуспендировать осадок.

Важно: не засасывайте дозатором сам осадок.

3. Приготовление лизирующих растворов Monarch для одного образца

Раствор для подготовки ядер

165 мкл буфера для подготовки ядер (Nuclei Prep Buffer);
5,5 мкл РНКазы А (RNase A).

Аккуратно перемешайте. Держите в холоде. Для эксперимента понадобится 150 мкл.

Раствор для лизиса ядер

165 мкл буфера (Nuclei Lysis Buffer)
11 мкл Протеиназы К (Proteinase K)

Аккуратно перемешайте. Держите при комнатной температуре. Для эксперимента понадобится 150 мкл.

В инструкцию намеренно заложен дополнительный объём, чтобы компенсировать возможную неточность дозирования.

4. Лизис клеток

Цель: вскрыть оболочки клеток и расщепить белки с сохранением длинной геномной ДНК.

• Добавьте к осаждённым клеткам 150 мкл раствора для подготовки ядер.

• Аккуратно наберите этот раствор в пипетку и вылейте 10 раз.

• Выдержите образец 2 минуты при комнатной температуре.

• Внесите 150 мкл раствора для лизиса ядер.

• Аккуратно переверните пробирку 10 раз.

• Не вортексируйте.

• Выдержите её при 56°C в течение 10 минут.

Как должен выглядеть успешный результат:

Жидкость в пробирке станет более тягучей.

Важно: не вортексируйте раствор после лизиса. На этом этапе главное — сохранить высокомолекулярную структуру ДНК.

5. Связывание ДНК с бусинами Monarch

Цель: обеспечить осаждение геномной ДНК на крупных бусинах для его захвата.

• Влейте в пробирку 75 мкл усилителя осаждения (Precipitation Enhancer).

• Аккуратно переверните её 8-10 раз.

• Внесите 2 бусины для захвата (DNA Capture Beads).

• Добавьте 275 мкл изопропанола.

• Медленно переверните пробирку 30 раз.

• Не вортексируйте.

Важно: теперь ДНК находится на бусинах. Не потеряйте их и не используйте на этом этапе этанол.

6. Промывка бусин с ДНК

Цель: смыть с бусин все загрязнения, сохранив на них ДНК.

• Дайте бусинам осесть на дно пробирки.

• Осторожно удалите жидкость, оставив в пробирке только бусины.

• Добавьте 500 мкл буферного раствора для промывки гДНК (gDNA Wash Buffer).

• Аккуратно переверните пробирку 2-3 раза.

• Осторожно удалите промывочный буфер дозатором.

• Добавьте ещё 500 мкл буферного раствора для промывки.

• Аккуратно переверните пробирку 2-3 раза.

• Осторожно удалите промывочный буфер.

• Максимально удалите остатки жидкости, не затрагивая бусины.

Важно: в буферный раствор уже должен быть добавлен этанол.

7. Элюция геномной ДНК

Цель: снять очищенную геномную ДНК с бусин.

• Вставьте ретейнер (bead retainer) в сборную пробирку Monarch.

• Перенесите или просто пересыпьте бусины в этот ретейнер.

• Выполните импульсное центрифугирование не дольше одной секунды.

• Перенесите бусины в чистую пробирку Monarch.

• Добавьте 100 мкл буферного раствора для элюции II (Elution Buffer II).

• Выдержите при 56°C в течение 5 минут.

• Установите ретейнер поверх чистой пробирки DNA LoBind с маркировкой «Extracted DNA».

• Перенесите полученную жидкость вместе с бусинами в ретейнер.

• Центрифугируйте при 12 000 × g в течение 30 секунд.

• Сохраните полученную жидкость (элюат).

Полученный элюат и является очищенной гДНК. Ни в коем случае его не выбрасывайте.

8. Измерение количества ДНК флюориметром

Цель: измерить, достаточно ли ДНК, чтобы приступать к подготовке библиотеки ONT.

Компоненты:

Набор 1x dsDNA High Sensitivity (HS)

Если вы используете уже готовый реагент 1X, не выбирайте в меню прибора старый протокол, который шёл без пометки «1X».

Стандарты

Стандарт №1:

190 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS;
10 мкл калибровочного раствора «Standard #1».

Стандарт №2:

190 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS;
10 мкл калибровочного раствора «Standard #2».

Измерение образца, первая попытка

198 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS
2 мкл ДНК

На приборе Qubit введите:

Sample volume = 2 µL

Если концентрация оказалась слишком низкой

Используйте большее количество ДНК, приготовив смесь в новой пробирке Qubit:

190 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS
10 мкл ДНК

На экране Qubit введите:

Sample volume = 10 µL

Только не пытайтесь просто долить 8 мкл ДНК в старую пробирку (где уже налито 198 + 2 мкл). В таком случае общий объём смеси составит 208 мкл, что полностью нарушит математические алгоритмы расчёта прибора.

Запишите результат:

Концентрация геномной ДНК (Genomic DNA concentration):
Остаточный объём ДНК (Remaining DNA volume):
Расчётное общее количество ДНК (Estimated total DNA):

Посчитайте:

Общее количество ДНК (нг) = концентрация по Qubit (нг/мкл) × остаточный объём (мкл).

Пауза

Это лучший момент, чтобы сделать перерыв в рамках одного дня.

Уберите извлечённую ДНК в холодильник (храните при 4°C).

Перед этим:

• Убедитесь, что ДНК находится в маркированной пробирке DNA LoBind.

• Выполните быстрое центрифугирование.

• Не вортексируйте.

• Плотно закройте.

• Уберите в холодильник.

По возвращении переходите к этапу 9.

9. Дозирование исходной ДНК перед этапом репарации

Цель: подготовить 47 мкл раствора исходной ДНК.

Идеальный целевой показатель:

1,000 нг ДНК в объёме 47 мкл.

Посчитайте:

Необходимый объём ДНК = 1000 нг / Концентрация по Qubit (нг/мкл).

Затем:

Объём воды = 47 мкл — Необходимый объём ДНК.

Если раствор с ДНК слишком разбавленный, и 1 000 нг не помещается в 47 мкл, используйте максимально возможный объём:

47 мкл извлечённой ДНК;
0 мкл воды.

Пример для первого запуска с малым количеством ДНК:

0,296 нг/мкл × 47 мкл = ~13.9 нг ДНК.

Это количество было гораздо ниже рекомендуемой нормы, но запуск всё равно оказался полезен в качестве тренировочного прогона всей цепочки процесса.

10. Репарация / подготовка краёв

Цель: восстановить повреждённую ДНК и подготовить её края к прикреплению адаптеров.

Используйте строго реагенты v2:

Буферный раствор для репарации (FFPE DNA Repair Buffer v2)
Смесь ферментов для репарации (FFPE DNA Repair Mix)
Ферментная смесь для подготовки концов (N-Prep Enzyme Mix / Ultra II End Prep Enzyme Mix)

Важно: на этом этапе нельзя использовать солевую лигазу Salt-T4 DNA Ligase. Она пригодится позднее.

Если вы не используете контрольную ДНК (DCS, DNA Control Strand), замените необязательный 1 мкл DCS на 1 мкл воды, свободной от нуклеаз.

Компоненты для реакции

47 мкл раствора ДНК;
1 мкл воды без нуклеаз;
7 мкл FFPE DNA Repair Buffer v2;
2 мкл FFPE DNA Repair Mix;
3 мкл N-Prep Enzyme Mix.

Общий объём = 60 мкл

Этапы

• Добавьте 47 мкл раствора ДНК в тонкостенную ПЦР-пробирку 0,2 мл с маркировкой «End-prep».

• Добавьте 1 мкл воды, свободной от нуклеаз.

• Добавьте 7 мкл FFPE DNA Repair Buffer v2.

• Аккуратно пропипетируйте смесь 10-20 раз.

• Добавьте 2 мкл FFPE DNA Repair Mix.

• Пропипетируйте смесь 10-20 раз.

• Добавьте 3 мкл N-Prep Enzyme Mix.

• Снова пропипетируйте 10-20 раз.

• Выполните быстрое центрифугирование.

Инкубация:

При 20°C в течение 5 минут.
При 65°C ещё 5 минут.
Затем поместите пробирку на лёд.

11. Очистка на магнитных шариках AMPure после репарации и подготовки краёв

Цель: очистить полученную ДНК после репарации и подготовки краёв.

Исходные материалы:

60 мкл реакционной смеси, полученной на предыдущем этапе.

Порядок действий:

• Вортексируйте флакон со взвесью магнитных шариков AMPure XP, пока жидкость не станет равномерно коричневого цвета.

• Добавьте 60 мкл взвеси AMPure XP к 60 мкл реакционной смеси.

• Аккуратно пропипетируйте 10 раз.

• Оставьте на 5 минут при комнатной температуре.

• Поставьте пробирку на магнитный штатив.

• Дождитесь полного осветления раствора.

• Отберите дозатором и слейте весь супернатант, стараясь не задеть магнитные шарики.

Промывка 1

• Не снимайте пробирку с магнита.

• Добавьте 200 мкл свежеприготовленного 80% этанола.

• Удалите этанол дозатором.

Промывка 2

• Добавьте ещё 200 мкл свежего 80% этанола.

• Также удалите его.

Просушивание

• Удалите остатки этанола дозатором P10 или P20.

• Недолго подсушите осадок на воздухе (около 30 секунд).

• Не пересушите.

• Не допускайте растрескивания шариков.

Элюция

• Снимите пробирку с магнитного штатива.

• Добавьте 61 мкл воды, свободной от нуклеаз.

• Аккуратно ресуспендируйте шарики.

• Выдержите 5-10 минут при комнатной температуре.

• Поместите пробирку обратно на магнит.

• Дождитесь полного осветления раствора.

• Перенесите 60 мкл чистого элюата в новую пробирку типа DNA LoBind с маркировкой «Ligation».

Важно: шарики в новую пробирку не переносите.

12. Лигирование адаптеров

Цель: прикрепить секвенирующие адаптеры Oxford Nanopore.

Компоненты:

LNB (буфер для лигирования);
LA (адаптер для лигирования);
Salt-T4 DNA Ligase (солевая лигаза Т4).

Компоненты реакционной смеси

60 мкл ДНК после репарации и подготовки концов;
25 мкл LNB;
10 мкл Salt-T4 DNA Ligase;
5 мкл LA.

Общий объём = 100 мкл

Этапы

• Используйте чистую пробирку DNA LoBind с меткой «Ligation».

• Перед добавлением LNB медленно перемешайте его с помощью дозатора. Этот буфер очень густой.

• Добавьте 60 мкл подготовленной ДНК.

• Добавьте 25 мкл LNB.

• Добавьте 10 мкл Salt-T4 DNA Ligase.

• Добавьте 5 мкл LA.

• Аккуратно пропипетируйте 10-15 раз.

• Не вортексируйте.

• Выполните быстрое центрифугирование.

• Выдержите 10 минут при комнатной температуре.

Перед выдерживанием вслух проговорите, все ли компоненты вы добавили:

DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase, LA.

Возможные ошибки ^[36]:

Забыли добавить LA = библиотека не получится, образец окажется непригоден для секвенирования.
Забыли добавить Salt-T4 DNA Ligase = лигирование адаптеров не произойдёт. 
Плохо перемешали LNB = реакция лигирования пройдёт неэффективно.
Использовали вортекс = ненужное фрагментирование ДНК.

13. Очистка библиотеки после лигирования адаптеров

Цель: удалить свободные адаптеры, остатки лигазы, соли и мелкие фрагменты ДНК, сохранив при этом целевую ДНК с пришитыми адаптерами.

Важно: здесь при очистке используется LFB, а не этанол.

Исходные материалы:

100 мкл реакционной смеси после лигирования. 

• Вортексируйте флакон с магнитными шариками AMPure XP.

• Добавьте 40 мкл взвеси AMPure XP к 100 мкл реакционной смеси.

• Аккуратно пропипетируйте 10 раз.

• Выдержите 5 минут при комнатной температуре.

• Поместите пробирку на магнит.

• Дождитесь полного осветления раствора.

• Не снимайте пробирку с магнита.

• Аккуратно удалите и слейте супернатант.

• Следите за тем, чтобы не задеть осадок шариков.

Промывка 1

• Добавьте 250 мкл LFB к шарикам.

• Снимите пробирку с магнита.

• Аккуратно ресуспендируйте шарики постукиванием по пробирке или медленным пипетированием.

• Поставьте пробирку обратно на магнит.

• Подождите, пока раствор станет прозрачным.

• Удалите и слейте LFB.

Промывка 2

• Добавьте очередные 250 мкл LFB.

• Снимите пробирку с магнита.

• Аккуратно ресуспендируйте шарики.

• Верните пробирку на магнит.

• Дождитесь осветления раствора.

• Удалите и слейте LFB.

• Удалите остаток LFB с помощью дозатора P10 или P20.

• Не пересушите.

Элюция

• Добавьте 25 мкл буферного раствора EB.

• Снимите пробирку с магнита.

• Аккуратно ресуспендируйте шарики.

• Выдержите раствор 10 минут при комнатной температуре.

• Верните пробирку на магнит.

• Дождитесь осветления элюата.

• Перенесите чистый элюат в чистую пробирку DNA LoBind с меткой «Final library».

Это ваша готовая библиотека для секвенирования.

Общее правило:

Жидкость убираем. Шарики оставляем.
В готовую библиотеку шарики не переносим.

14. Повторная проверка количества ДНК

Цель: измерить итоговую концентрацию ДНК в готовой библиотеке.

Поскольку при запуске с малым количеством исходного материала на выходе получается крайне низкая концентрация, прибор может показать очень малые значения или выдать ошибку.

Компоненты:

199 мкл рабочего раствора 1X dsDNA HS;
1 мкл раствора готовой библиотеки.

На экране Qubit укажите:

Sample volume = 1 µL

Запишите результаты:

Концентрация ДНК в готовой библиотеке:
Объём готовой библиотеки:
Расчётная масса загружаемой ДНК:

Рассчитайте:

Загружаемая масса (нг) = концентрация готовой библиотеки (нг/мкл) × 12 мкл

Если концентрация готовой библиотеки оказалась слишком низкой, не тратьте остатки образца на повторные измерения на Qubit, переводя драгоценные реактивы. Для тренировочного прогона просто добавьте 12 мкл библиотеки в загрузочную смесь.

15. Проверка проточной ячейки в программе MinKNOW

Цель: проверить работоспособность проточной ячейки перед загрузкой библиотеки.

• Достаньте проточную ячейку из холодильника.

• Оставьте её при комнатной температуре 20 минут.

• Держите её строго в горизонтальном положении.

• Не встряхивайте.

• Подключите секвенатор MinION к компьютеру.

• Запустите MinKNOW.

• Вставьте проточную ячейку в секвенатор.

• Запустите проверку (Run flow cell check).

• Запишите количество активных пор (Active pores).

Таблица оценки качества ячейки:

>1200 пор = отлично.
800—1200 пор = пригодно.
500—800 пор = посредственно, подходит для тренировочных запусков.
<500 пор = плохо, но ещё сгодится для отработки механики процесса.
<200 пор = подходит только для тренировки самой загрузки. 

Запишите результаты:

Идентификатор ячейки (Flow cell ID):
Начальное количество активных пор (Starting active pores):
Срок хранения ячейки (Flow cell age):
Использовалась ранее? (Previously used, да/нет):
Промывалась после использования? (Washed, да/нет):

16. Разбираемся с итоговыми пробирками и портами

В конечном итоге у вас получится три пробирки:

Пробирка 1: Final library (итоговая библиотека)
- Ваша готовая библиотека ДНК после очистки и пришивания адаптеров.

Пробирка 2: Priming mix (смесь для прайминга)
- Раствор для подготовки проточной ячейки к работе.

Пробирка 3: Loading mix (загрузочная смесь)
- Смесь, содержащая итоговую библиотеку, буфер для секвенирования и магнитные шарики.

На самой проточной ячейке есть два порта:

Порт 1: Priming port (порт для прайминга)
- Находится под пластиковой задвижкой. В него заливается смесь для прайминга.

Порт 2: SpotON sample port (для внесения образца)
- Небольшое углубление для ввода образца. В него по каплям вносится загрузочная смесь.

Важно: готовая библиотека не помещается напрямую в саму проточную ячейку. Сначала мы переносим её в пробирку с загрузочной смесью.

17. Приготовление смеси для прайминга проточной ячейки

Если в наличии есть БСА (BSA):

1170 мкл FCF;
5 мкл BSA (бычий сывороточный альбумин);
30 мкл FCT.

Общий объём = 1205 мкл.

Если BSA нет, и это тренировочный запуск:

1170 мкл FCF;
30 мкл FCT.

Общий объём = 1200 мкл.

Важно: нельзя заменять BSA на SFB, DCS, LIS или LNB.

Смешивайте всё осторожно, не допускайте образования пузырьков воздуха.

Это будет Пробирка №2: Priming mix.

18. Первый прайминг

Выполняйте только после проверки проточной ячейки. Предварительно посмотрите видео ниже. В нём наглядно показано, как правильно вносить растворы в ячейку.

• Не отключайте проточную ячейку от прибора и держите её в строго горизонтальном положении.

• Откройте задвижку порта для прайминга.

• Проверьте, нет ли рядом с портом пузырьков воздуха.

Для удаления остатков воздуха подтяните обратно 20-30 мкл раствора:

Установите на пипетке P1000 значение 200 мкл.
Опустите её кончик в порт для прайминга.
Медленно прокрутите колёсико изменения объёма вверх до отметки 220-230 мкл.
Остановитесь, как только в кончик начнёт поступать жидкость.
Дальше не вытягивайте.

Теперь медленно введите в порт:

800 мкл смеси для прайминга

Избегайте появления пузырьков.

Подождите 5 минут.

19. Приготовление загрузочной смеси во время 5-минутного ожидания

Пробирка №3: Loading mix

Потребуется:

37,5 мкл SB;
25,5 мкл LIB;
12 мкл готовой библиотеки.

Общий объём = 75 мкл.

Важно:

LIB — это Library Beads из набора ONT. Не перепутайте их с магнитными шариками AMPure XP.

LIB быстро оседают. Перемешивайте их перед набором в дозатор.

Порядок действий:

• Перемешайте флакон с LIB непосредственно перед пипетированием.

• Добавьте 37,5 мкл SB в чистую пробирку.

• Добавьте 25,5 мкл LIB.

• Добавьте 12 мкл готовой библиотеки.

• Аккуратно перемешайте с помощью пипетирования.

• Не вортексируйте пробирку.

20. Второй прайминг

После 5-минутного ожидания введите в порт для прайминга:

200 мкл смеси для прайминга.

Не допускайте образования пузырьков воздуха.

21. Загрузка библиотеки в порт SpotON

• Непосредственно перед загрузкой аккуратно перемешайте содержимое пробирки №3.

• Откройте порт SpotON.

• Внесите все 75 мкл загрузочной смеси в порт.

• Добавляйте их по одной капле.

• Каждый раз обязательно дожидайтесь, пока предыдущая капля полностью уйдёт.

• Не спешите.

• Не тыкайте кончиком дозатора в порт.

• Избегайте образования пузырьков.

Затем:

Закройте крышку SpotON.
Закройте порт для прайминга.
Установите светозащитный экран.
Закройте крышку секвенатора MinION.
Запустите секвенирование в MinKNOW (Start run).

Общая памятка:

Смесь для прайминга → вводится в порт для прайминга под сдвижной крышкой.
Загрузочная смесь → капается в открытый порт для образца SpotON.
Готовая библиотека → никогда не капается в сам прибор, а предварительно смешивается 
с загрузочной смесью.

22. Секвенирование ДНК с помощью MinKNOW

Рекомендуемые базовые настройки:

Flow cell type (тип проточной ячейки): FLO-MIN114
Kit (набор реагентов): SQK-LSK114
Basecalling (бейсколлинг): ON
Model: High-accuracy / HAC
Barcoding (баркодирование): OFF
Alignment (Выравнивание): OFF
Adaptive sampling (адаптивное секвенирование): OFF
Raw reads / POD5 (Сырые данные): ON
Filtering (фильтрация): OFF при выполнении тренировочных запусков с низкой концентрацией ДНК.

После этого:

Save configuration
Start

Для тренировочных запусков включайте POD5, чтобы данные можно было проанализировать позднее, даже если текущие данные в реальном времени окажутся слабыми.

23. Запуск бейсколлингка после завершения анализа (при необходимости)

• Найдите каталог, куда сохранились сырые файлы POD5.

• Установите Dorado.

• Запустите бейсколлинг:

dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam

• При необходимости конвертируйте полученный BAM-файл в формат FASTQ:

samtools fastq calls.bam > reads.fastq

• Если захотите ускорить первый прогон, используйте вместо SUP модель HAC:

dorado basecaller hac pod5_directory/ > calls.bam

24. Сопоставление полученных чтений с референсным геномом человека

• Скачайте файл референсного генома GRCh38 в формате FASTA.

• Проиндексируйте референс:

minimap2-d GRCh38.mmi GRCh38.fa

• Сопоставьте полученные чтения с референсом:

minimap2-ax map-ont GRCh38.mmi reads.fastq | samtoolssort-o aligned.bam

• Проиндексируйте BAM:

samtools index aligned.bam

• Просмотрите итоговую статистику сопоставления:

samtools flagstat aligned.bam > flagstat.txt

• Проверьте покрытие генома:

mosdepth sample_cov aligned.bam

25. Поиск вариантов

• Установите ПО Clair3.

• Используйте модель ONT.

• Запустите Clair3, указав путь к референсному файлу GRCh38, упорядоченному BAM и каталогу для вывода результатов.

• Убедитесь, что в выходных данных будет присутствовать файл VCF.

• Не делайте глубоких выводов на основе вариантов, найденных в зонах с низким покрытием ДНК.

• Относитесь к своему первому запуску MinION как к технической проверке, а не полноценной медицинской диагностике.

26. Аннотация вариантов

• Установите ПО VEP.

• Аннотируйте полученный VCF-файл относительно референса GRCh38.

• Подключите БД ClinVar.

• Подключите БД gnomAD.

• Позже также можете подключить БД PharmGKB.

• Сохраните итоговую таблицу со следующими столбцами:

  • chromosome — хромосома,

  • position — позиция в геноме,

  • ref — эталонный аллель,

  • alt — альтернативный аллель,

  • gene — название гена,

  • consequence — молекулярное следствие,

  • ClinVar significance — клиническая значимость,

  • gnomAD frequency — популяционная частота,

  • genotype — генотип ^[37],

  • read depth — глубина прочтения,

  • variant quality — качество определения варианта.

*Twitter (X) заблокирован на территории России решением Роскомнадзора в соответствии с требованиями законодательства